Chromatographie en phase liquide
La chromatographie est l'un des outils les plus puissants de la chimie analytique et l'un des instruments les plus courants en laboratoire. Pour cette technique, la phase mobile est un liquide.
Chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC)
La chromatographie en phase liquide à haute pression, désormais connue sous le nom de chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC), est une technique chromatographique utilisée afin d'identifier, de quantifier, de séparer et de purifier les composés individuels présents dans un mélange [1].
Comment la chromatographie en phase liquide à haute performance fonctionne-t-elle ?
Dans la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC), on fait passer le mélange échantillon avec un solvant liquide sous haute pression, à travers une colonne remplie d'un matériau adsorbant solide. La pression à l'intérieur du système est établie à l'aide de pompes. Le principe de fonctionnement est que chaque composé du mélange interagit légèrement différemment avec le matériau adsorbant de la colonne, ce qui entraîne des débits variables pour les différents composants. Ceci conduit à une séparation des composants à mesure qu'ils sortent de la colonne. Le matériau adsorbant utilisé est généralement granulaire et est constitué de particules solides, telles que la silice, qui constituent la “ phase stationnaire ”. Le liquide pressurisé est un mélange de solvants, tels que l'eau et des liquides organiques, à l'image du méthanol et de l'acétonitrile, qui constituent la “ phase mobile ”.
Le détecteur est connecté à un microprocesseur numérique et à un logiciel utilisateur pour l'acquisition et l'analyse des données. Les composés séparés sont visualisés sous forme de pics, le nombre de pics correspondant au nombre de composants séparés dans le mélange. La zone du pic est proportionnelle à la concentration du composé présent dans le mélange [2]. La résolution entre deux pics pour les techniques chromatographiques correspond à la mesure dans laquelle les substances sont séparées au cours de l'expérience. Une résolution plus élevée reflète une bonne séparation des composés.
À quoi sert la chromatographie en phase liquide à haute performance ?
La chromatographie en phase liquide à haute performance présente une vaste gamme d'applications dans les domaines de la biochimie, de la chimie analytique, des produits pharmaceutiques, de la criminalistique, de la recherche alimentaire et dans d'autres domaines. Par exemple, l'HPLC est également utilisée pour tester les substances interdites chez les athlètes.
Pourquoi utiliser la chromatographie en phase liquide à haute performance ?
L'HPLC est à la fois abordable et flexible. Elle offre des avantages utiles tels que la gestion des données et la validation des instruments.
Chromatographie en phase liquide à ultra-haute performance (UHPLC)
La chromatographie en phase liquide à ultra-haute performance (UHPLC) est une variante de l'HPLC, qui utilise des particules plus petites pour améliorer la performance chromatographique et qui nécessite des pressions plus élevées. Tout comme pour l'HPLC, les contaminants de l'eau peuvent avoir un impact négatif sur les résultats, cependant, en raison des sensibilités plus élevées de l'UHPLC, cela peut être plus extrême.
L'HPLC et l'UHPLC peuvent être utilisées pour la chromatographie en phase liquide, mais l'équipement nécessaire pour leur fonctionnement diffère et chacune présente des avantages différents. La longueur plus courte de la colonne signifie que la chromatographie en phase liquide à ultra-haute performance offre une meilleure résolution que l'HPLC traditionnelle.
Chromatographie ionique
La chromatographie ionique permet la séparation des ions et des molécules polaires en fonction de leur interaction avec une colonne de milieux échangeurs d'ions. Elle peut être utilisée pour presque tous les types de molécules chargées, notamment les protéines de grande taille, les petits nucléotides et les acides aminés. Elle est très largement utilisée pour le dosage des cations et anions inorganiques et organiques.
La qualité de l'eau du réactif influe sur presque tous les aspects de l'analyse HPLC, de la préparation de l'échantillon et de l'étalon au rinçage et à l'élution de la colonne. Cela fait également de l'eau le réactif le plus consommé en HPLC.
Généralement, de l'eau pure (de type II) est utilisée pour préparer les témoins, les étalons, les éluants et pour le prétraitement de l'échantillon. Cependant, l'HPLC à gradient pouvant présenter des limites de détection extrêmement basses, l'exigence en eau est plus stricte et la plus haute qualité est requise.
Une grande partie des problèmes de performance de l'HPLC sont liés à la mauvaise qualité de l'eau utilisée dans la préparation des éluants, des étalons et des échantillons de l'HPLC. Une eau de mauvaise qualité ou contaminée affecte la résolution en introduisant des pics fantômes, en modifiant la sélectivité de la phase stationnaire et en impactant les bases de référence au cours de la séparation chromatographique.
Par ailleurs, elle peut conduire à l'accumulation de contaminants dans la phase stationnaire, ce qui peut provoquer un blocage de la colonne. Il en résulte une augmentation de la pression et un décalage de la durée de l'analyse de l'échantillon. Des données de mauvaise qualité dues au décalage des temps de rétention, à la perte de résolution ou aux pics fantômes pourraient indiquer une contamination due aux matières organiques, aux ions, aux bactéries ou aux particules.
Quels sont les différents types de contaminants dans l'eau qui influent sur les résultats de l'HPLC ?
1. Contamination organique
La contamination organique de l'eau ultra-pure pourra affecter la séparation chromatographique de différentes façons :
(i) Réduction de la durée de vie de la colonne - Les molécules organiques qui se lient à la surface de la colonne peuvent ralentir l'accès des molécules d'échantillon et de solvant aux sites de liaison, au sein des billes de la colonne (phase stationnaire). Il en résulte une diminution de la capacité de la colonne à séparer les composés ou une perte de résolution et une durée de vie plus courte de la colonne.
(ii) Réduction de la sensibilité - Les molécules organiques dans l'eau éluante peuvent entrer en compétition avec les molécules de l'échantillon pour se lier aux billes de la colonne (phase stationnaire). Ceci diminue le nombre de molécules de l'échantillon se liant à la colonne, réduisant par conséquent le nombre de molécules libérées au cours du processus d'élution.
((iii) Données inexactes - Des pics de contaminants ou fantômes peuvent être obtenus à partir des matières organiques susceptibles de s'accumuler au niveau de la tête de colonne et d'être ensuite recueillies sous forme d'éluat.
(iv) Décalage dans le temps de rétention - Des niveaux élevés de matières organiques peuvent créer une nouvelle phase stationnaire dans la colonne, ce qui peut entraîner un décalage dans le temps de rétention et le pic de résidus. Cela peut également entraîner une augmentation de la contre-pression.
Il est par conséquent indispensable de surveiller avec précision le niveau de matières organiques dans l'eau utilisée pour les applications d'HPLC. Le carbone organique total (COT) est une mesure de l'ensemble des espèces organiques présentes dans l'eau. Le COT est mesuré en unités de parties par million (ppm) ou parties par milliard (ppb). Les composés organiques, présents dans des ppb élevés, peuvent modifier l'identification spectrale des composants à l'état de traces dans le mélange et influencer la quantification des pics.
Un système HPLC peut être contaminé par une grande variété de sources de COT. Il s'agit notamment de l'eau, de la lixiviation à partir des milieux de purification, des tubes et des contenants, de la contamination bactérienne et éventuellement de l'absorption à partir de l'atmosphère. Il est dorénavant recommandé d'éviter d'utiliser de l'eau embouteillée de pureté élevée qui n'a pas été fraîchement purifiée. En effet, l'eau embouteillée pour l'HPLC qui est restée en laboratoire pendant plus de 8 h (exposition aux matières organiques atmosphériques) ou l'eau distillée sont susceptibles d'augmenter les niveaux de COT.
Fig 1: Comparison of the TOC levels in HPLC-grade water and Ultrapure water.
La figure 1 compare la sortie du chromatogramme de l'eau de qualité HPLC et de l'eau ultra-pure mesurée à des longueurs d'ondes de 254 nm et 214 nm. L'eau de qualité HPLC présente des niveaux de COT plus élevés qui s'éluent de la colonne provoquant des décalages de la base de référence, avec une taille et un nombre de pics accrus, par rapport à l'eau ultra-pure [2].
Par conséquent, l'utilisation d'eau pure est essentielle pour l'analyse HPLC et il est important de conserver une eau exempte de toutes sortes de contaminants. En plus de garantir la pureté des solvants organiques, des étalons et des autres composants de la phase mobile de l'HPLC, les chromatographes doivent également veiller à ce que l'eau du réactif soit de qualité élevée et exempte de tout contaminant.
2. Particules et colloïdes
La présence de particules et de colloïdes dans l'échantillon d'eau peut endommager la pompe et l'injecteur, en plus de bloquer physiquement la colonne. Ceux-ci peuvent également se comporter comme une phase solide au sein de la colonne, se liant aux constituants de l'échantillon. Des colloïdes peuvent également s'adsorber de manière irréversible sur le matériau de revêtement de la colonne, empêchant ainsi les constituants de l'échantillon de se lier à la colonne.
3. Ions
La présence d'ions dans le solvant peut également avoir des conséquences sur les séparations chromatographiques. D'éventuels ions absorbant les UV, tels que les nitrates, les nitrites, les sulfates, les bromures, les chlorures et les fluorures, peuvent traverser la colonne et apparaître comme un pic dans le chromatogramme, ce qui rend les données difficiles à analyser.
Parmi les différents contaminants de l'eau qui influent sur l'analyse HPLC, les substances organiques sont de loin les déterminants les plus importants de la pureté de l'eau. Des preuves expérimentales ont fortement suggéré que l'eau ultra-pure fraîchement préparée devrait être le choix pour toute HPLC, car d'autres sources d'eau, à savoir l'eau distillée ou même l'eau embouteillée de qualité HPLC, contiennent des quantités relativement élevées de substances organiques, ce qui peut compromettre la qualité des chromatogrammes et les performances de l'appareil (voir figure 1).
Il est par conséquent impératif de veiller à ce que des systèmes de purification de l'eau de qualité élevée soient utilisés et que le système lui-même soit correctement entretenu.
Mesure de l'eau
Veillez à utiliser le type d'eau adéquat en fonction de votre application. Voici les exigences pour les applications de chromatographie en phase liquide :
| Sensibilité requise | Résistivité (MΩ.cm)* | COT (ppb) | Filtre (µm) | Bactéries (UFC/ml) | Endotoxines (EU/ml) | Nucléases | Qualité de l'eau |
| Chromatographie ionique | Général élevé(e) | > 5 18,2 | < 50 < 10 | < 0,2 < 0,2 | < 10 < 1 | s/o s/o | s/o s/o | Eau de laboratoire de qualité standard Eau ultra-pure (type 1) |
| HPLC | Général élevé(e) | > 1 > 18 | < 50 < 3 | < 0,2 < 0,2 | < 1 < 1 | s/o s/o | s/o s/o | Eau de laboratoire de qualité standard Eau ultra-pure (type 1) |
Comment ELGA Veolia résout les problèmes de pureté de l'eau pour l'HPLC ?
Il existe actuellement différents systèmes de purification disponibles, chaque méthode ayant ses propres avantages et limites. L'expertise d'ELGA dans les systèmes de purification de l'eau bénéficie d'une réputation de longue date. ELGA a classé la pureté de l'eau en différentes catégories, ce qui peut aider à déterminer le niveau de pureté de l'eau requis pour une application donnée. Par exemple, notre système PURELAB® Chorus 1 de recherche analytique fournit de l'eau ultra-pure de type I avec des niveaux de COT très bas (2 ppb), ce qui est particulièrement approprié pour les expériences d'HPLC. ELGA fournit des systèmes de purification de l'eau qui sont ergonomiques, rentables et qui requièrent peu d'entretien.
Conclusions
La pureté de l'eau en tant que réactif de laboratoire est essentielle à des expériences réussies. Les technologies hautement sensibles, telles que la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC), nécessitent une eau d'une très grande pureté, ce qui signifie que l'eau utilisée doit avoir des teneurs minimales en COT et être exempte de tout autre contaminant. L'eau ultra-pure fraîchement préparée est le choix pour les expériences d'HPLC et la vaste gamme de systèmes de purification de l'eau d'ELGA aide les chercheurs du monde entier à s'assurer que l'eau utilisée dans leurs expériences offre la pureté désirée.
Bibliographie :
[1] Jena A Kumar. HPLC: Highly Accessible Instrument in Pharmaceutical Industry for Effective Method Development (HPLC : instrument hautement accessible dans l'industrie pharmaceutique pour l'élaboration de méthodes efficaces). Pharm. Anal Acta 2012 ;3. doi :10.4172/2153-2435 .1000147 (anales pharmaceutiques)
[2] Malviya R, Bansal V, Prakash Pal O, Kumar Sharma P. High performance liquid chromatography : A short review. (Chromatographie en phase liquide à haute performance : un examen rapide). J Glob Pharma Technol 2010 ;2 : 22-6.
